Química

Métodos de ingeniería genética


Secuencia de una PCR

La reacción en cadena de la polimerasa es un proceso cíclico en el que se repiten tres pasos hasta que la reacción se detiene.

  1. Derretir el ADN bicatenario (desnaturalización) El molde para la PCR es en la mayoría de los casos uno bicatenario ADN1), pero también puede ser un ARN2) puede ser usado. A altas temperaturas, la doble hebra de ADN se funde en dos independientes y complementarias.3) Hebras de ADN. En el primer paso de una PCR, que generalmente tiene lugar a aproximadamente 92 ° C durante 30 segundos, las cadenas dobles de ADN se separan entre sí.
  2. Unión de oligonucleótidos cortos al ADN monocatenario (hibridación del cebador) Un cebador es un fragmento corto de ADN monocatenario. Este cebador encuentra su "contraparte" en el ADN igualmente monocatenario, es decir, una secuencia complementaria a este cebador, y se une a él. La temperatura a la que se lleva a cabo este paso depende de la temperatura de fusión de los cebadores utilizados y se calcula con precisión para cada experimento. Si la temperatura es demasiado alta, el cebador ya no puede unirse; si es demasiado baja, el cebador también se une a otros sitios del ADN. Las condiciones habituales son, por ejemplo, 50-60 ° C durante 30 segundos.
  3. La extensión del cebador por la enzima ADN polimerasa (extensión del cebador) La ADN polimerasa es una enzima que convierte el ADN de una sola hebra de nuevo en una doble hebra. Sin embargo, para hacer esto, se requiere una longitud corta de doble hebra, como en el paso anterior uniendo el cebador al que se originó el ADN. La ADN polimerasa reconoce el extremo 3 'libre del cebador y ahora agrega nucleótido a nucleótido hasta que la doble hebra de ADN se completa nuevamente. Este paso tiene lugar a la temperatura óptima de la polimerasa, es decir, en el caso de una polimerasa termoestable a una temperatura de aproximadamente 72 ° C durante 60 segundos.

El resultado de estos tres pasos de una PCR son dos moléculas de ADN, las cuales se han complementado nuevamente para formar una doble hebra. Cuando se completa este último paso, el ciclo comienza de nuevo: ambas hebras dobles ahora se funden en cuatro hebras simples. y luego se agrega de nuevo a cuatro hebras dobles, y así sucesivamente.


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